Svou hereckou kariéru Timothy Olyphant nastartoval koncem 90. let 20. století a záhy si získal uznání díky roli v populárním seriálu Deadwood.
Do povědomí široké divácké obce se Timothy Olyphant dostal díky filmům Vřískot 2, 60 sekund, Osamělý mstitel, Hitman (v němž si zahrál hlavní roli), Dokonalý únik či Tenkrát v Hollywoodu.
V letech 2011 až 2015 Timothy Olyphant ztvárnil hlavní postavu v populárním westernovém seriálu Justified a v letech 2017 až 2019 účinkoval v seriálu Santa Clarita Diet. Za roli v seriálu Justified byl nominován na cenu Primetime Emmy.
V seriálu The Mandalorian Timothy Olyphant zpodobnil postavu Cobba Vantha, bývalého otroka, který se stane šerifem odlehlého města Tatooine.
Jednu z klíčových postav si Timothy Olyphant zahrál v tragikomedii Špaček či v thrilleru Havoc.
Prosadil se též jako producent. Timothy Olyphant se podílel na několika úspěšných televizních projektech.
V roce 1991 se Timothy Olyphant oženil s Alexis Knief, s níž má tři děti.