Herecký talent se u Jonathana Groffa projevil již v raném věku. Na cenu Tony byl v roce 2006 nominován za roli Melchiora Gabora v broadwayské inscenaci Spring Awakening.
Svůj výrazný hlas Jonathan Groff propůjčil postavě Kristoffa v animovaných hitech společnosti Disney Frozen a Frozen II. Zahrál si v několika televizních seriálech, mj. roli Jesseho St. Jamese v populárním hudebním seriálu Glee.
Uznání kritiky se Jonathanu Groffovi dostalo za ztvárnění Holdena Forda, postavy založené na reálném agentovi FBI Johnu E. Douglasovi, v krimi seriálu Lovec myšlenek.
Jevištní kariéra Jonathana Groffa zahrnuje účinkování v různých Shakespearových hrách. Další uznání kritiků i diváků přišlo za ztvárnění krále Jiřího III. v broadwayském muzikálu Hamilton, za nějž společně s ostatními herci získal cenu Grammy za nejlepší muzikálové album. Za účinkování v divadle dostal Drama Desk Awards.
Zahrál si např. ve sci-fi akčňáku The Matrix Resurrections (2021). V roce 2022 byl Jonathan Groff výkonným producentem dokumentárního filmu HBO Spring Awakening: Those You've Known, v němž se po patnácti letech sešlo původní obsazení muzikálu.
Hlavní roli, Patricka Murraye, designéra videoher, který vyrůstal na předměstí Denveru v poměrně konzervativní rodině, která zpočátku těžko přijímala jeho sexualitu, začal Jonathan Groff hrát v seriálu HBO Max Hledání (Looking). Seriál měl premiéru v lednu 2014. V roce 2023 přišla na obrazovky další série, v níž se mj. vyrovnává se zasnoubením svého přítele.
V hororovém mysteriózním thrilleru Někdo klepe na dveře (Knock at the Cabin), natočeném podle knižní předlohy amerického spisovatele Paula Tremblayeho, Jonathan Groff ztvárnil Erica, jednu z klíčových postav. Film byl na AppleTV Plus uveden v únoru 2023.
Kromě herectví se Jonathan Groff věnuje zpěvu a skládání.
Ve dvaceti letech byl Jonathanu Groffovi diagnostikován melanom a podstoupil operaci. V říjnu 2009 se veřejně přiznal k homosexualitě, a to na dotaz reportéra serveru Broadway.com během Národního pochodu za rovnoprávnost.